水稻细菌性、真菌性和病毒性疾病严重威胁粮食生产与安全。现有检测方法（如传统培养、qPCR、免疫学方法等）存在?依赖专业设备、耗时、成本高?或存在?交叉反应?等缺陷，无法满足田间即时检测（POCT）的需求。

核心技术：Cas-PfLAMP平台

1.?原理?：PAM-free LAMP扩增?：为避免CRISPR/Cas12a系统对PAM序列（如TTTN）的严格依赖，本研究?在LAMP引物（FIP）的F2与F1c连接区（Linker region）预插入了一个TTTT PAM序列?，使得扩增产物天然包含可被Cas12a识别的PAM位点。这种“PAM-free”设计极大地提升了方法的通用性和灵活性。CRISPR-Cas12a检测?：利用设计好的特异性单链向导RNA引导?FnCas12a?蛋白识别并切割含PAM位点的LAMP扩增产物。此过程激活Cas12a的?反式切割（trans cleavage）活性?，无差别切割反应体系中的?单链DNA荧光报告探针?。

结果判读?：开发了?荧光实时监测?和?侧流层析试纸条（LFS）? 两种可视化方案。

荧光法?：使用FAM-淬灭基团标记的报告探针，阳性结果释放荧光。

试纸条法（LFS）?：使用FAM-生物素双标记的报告探针，切割后产物在试纸条上显示?检测线（T线）?，结果直观可视，无需任何仪器。

 其中，使用的LFS是来自沃博生物warbio的CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条,货号JY0301。

2.?平台优势?：“双保险”特异性?：结合了?LAMP引物（识别6个位点）? 和?CRISPR sgRNA特异性识别?的双重精准识别机制，有效降低了传统LAMP因非特异性扩增导致的假阳性。

操作简便?：全程恒温反应（LAMP：65°C；CRISPR/Cas12a切割：37°C），可使用便携式设备（如智能保温杯）加热，非常适合田间操作。

快速核酸提取?：配套使用?商业化固相核酸提取试剂盒?，无需研磨叶片，?5分钟内?即可完成大批量样品处理。

性能评估

1.?灵敏度?：使用标准质粒作为校准品进行测试。对于?水稻白叶枯病菌（XOO）?，检测限为?9 拷贝/反应?。对于?水稻条纹病毒（RSV）? 和?水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）?，检测限均低至?3 拷贝/反应?。当结合试纸条（LFS）读数时，灵敏度略降为9 拷贝/反应。灵敏度主要得益于?LAMP的高效扩增?和?Cas12a反式切割的信号级联放大?。

2.?特异性?：对包括其他黄单胞菌属细菌、多种水稻病毒在内的?总计25种相关病原菌/病毒菌株?进行交叉反应测试。 结果显示，三个Cas-PfLAMP检测体系?均无交叉反应，特异性高达100%?，仅对各自的目标病原体产生阳性信号。

3.?现场样本验证?：从上海交通大学闵行校区水稻田中采集14份叶片样本，利用集成了?固相提取、便携加热和LFS试纸条?的完整现场平台进行检测。操作全程仅需约60分钟?（样品间并行处理）。检测结果与实验室传统PCR/RT-PCR和LAMP验证结果?完全一致?，证明了该平台在实际田间应用中的?可靠性和实用性?。

结论与意义

        本研究成功构建了一个名为?Cas-PfLAMP?的检测平台。该平台的?核心创新点在于通过改造LAMP引物“预埋”PAM序列，突破了CRISPR检测对靶标序列天然PAM位点的依赖性?。结合开发的?全流程现场检测平台（提取→扩增→试纸条判读）?，该系统实现了对水稻重要病原体的?快速（~50-60分钟）、超灵敏（<10 拷贝）、高特异且无需专业设备?的现场诊断。这一平台不仅能有效应用于水稻病害监测，其?“PAM-free”设计理念?也可扩展至其他动植物病害及各类核酸即时检测领域。  

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