沙眼衣原体作为全球高发的性传播病原体及可预防性致盲的主要病因，对人类健康构成严重威胁，可引发泌尿生殖道感染、沙眼及新生儿结膜炎等多种疾病。而传统检测方法依赖实验室设备、操作繁琐且耗时较长，难以满足基层及现场快速筛查的需求。

01、核心原理与技术

1.?靶标基因?：针对沙眼衣原体高度保守的基因组区域设计引物和向导RNA。

2.?单管集成反应?：采用创新的?“管中管”结构?，将重组酶辅助扩增（RAA）反应体系与CRISPR-Cas12a检测体系物理分隔在同一反应容器内。第一步（39°C，20分钟）?：位于内管的RAA体系对目标核酸进行等温扩增。第二步（混合后，39°C，5分钟）?：使用穿刺棒刺破内管底部，通过离心混合RAA扩增产物与位于外管的CRISPR-Cas12a检测试剂。Cas12a在crRNA引导下识别靶标DNA，激活其反式切割活性，切割单链DNA荧光报告探针（FAM标记），释放荧光信号。

3.?信号读取?：通过配套的?便携式4通道荧光检测仪?实时监测荧光动力学曲线，结果可通过连接的终端应用程序进行可视化判读。也可通过更换为生物素标记的探针，使用侧流层析试纸条进行结果判读。 

  其中，使用了沃博生物（warbio）RPA技术与相关试剂，CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条,货号JY0301。 

02、方法开发与优化

1.?引物与crRNA筛选?：设计了4对RAA引物，通过凝胶电泳筛选出最优引物对（F1R1）。针对RAA扩增区域内的PAM位点（TTTN），设计了沙眼衣原体特异性的crRNA。2.?反应体系优化?：RAA反应体积?：确定?10 μL?为最佳反应体积。CRISPR-Cas12a反应体系?：优化后确定?Cas12a蛋白浓度为250 nM?，?crRNA浓度为200 nM?时，切割效率最佳。单管结构?：优化后采用RAA体系15.5 μL，CRISPR体系40 μL的“管中管”设计，实现了理想的检测性能。

03、性能评估

1.?灵敏度?：对沙眼衣原体质粒DNA进行10倍梯度稀释检测。该单管平台的?检测限为101 拷贝/mL?。作为对比，实验中使用的qPCR方法的检测限为102 拷贝/mL，表明该平台具有?与qPCR相当甚至更优的灵敏度?。

2.?特异性?：使用其他常见生殖道病原体（淋病奈瑟菌、解脲脲原体、白色念珠菌、阴道毛滴虫、阴道加德纳菌等）的DNA进行交叉反应测试。结果显示，?仅沙眼衣原体样本产生阳性信号，与其他所有测试病原体均无交叉反应?，证明了方法的高特异性。3.?临床样本验证?：使用87份临床阴道/宫颈拭子样本（残留样本）进行验证。以qPCR作为参考方法（检出28例阳性，59例阴性）。本平台检出29例阳性，58例阴性。

性能指标?：灵敏度?：100.00% (95% CI: 87.66–100.00%)

特异性?：98.31% (95% CI: 90.91–99.96)

总符合率?：98.85% (95% CI: 93.76–99.97)

阳性预测值?：96.55% (95% CI: 80.04–99.49)

阴性预测值?：100.00% (95% CI: 93.84–100.00%) 

结果表明，该平台与qPCR结果高度一致，即使在qPCR Ct值较高的样本中，也能观察到明显的荧光曲线上升。

04、方法优势与创新点

05、结论与展望

本研究成功构建了一种基于单管RAA-CRISPR-Cas12a的沙眼衣原体快速、超灵敏、特异性检测平台。临床验证表明其性能与qPCR高度一致，为沙眼衣原体感染的早期诊断和现场筛查提供了一种强有力的新型技术手段。

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