产品展厅
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产品信息
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货号 |
产品名称 |
规格 |
价格 |
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32116-01 |
AacCas12b (C2c1) |
100 pmoL |
1260 |
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32116-03 |
AacCas12b (C2c1) |
1,000 pmoL |
6280 |
产品简介
AacCas12b 核酸酶(又名 C2c1)是依赖于 RNA 介导的内切核酸酶，在靶标 DNA 存在 PAM(TTN)的情况
下，可特异地剪切靶标双链 DNA，使 DNA 双链断裂并生成粘性末端。而 AacCas12b 特异地剪切单链 DNA
靶标不依赖 PAM 序列。此外，双链或单链 DNA 靶标均能激活 AacCas12b 的反式剪切活性(即旁路剪切活
性/附属剪切活性)，即当 AacCas12b 酶与 sgRNA、靶标 DNA 结合形成三元复合物后，便会被激活针对非
特异序列 ssDNA 的反式剪切活性，将体系中的任意序列 ssDNA 切碎。
AacCas12b 来源于嗜酸耐热菌 Alicyclobacillus acidoterrestris，最佳剪切反应温度为 48℃。AacCas12b依赖于 crRNA 和 tracrRNA(或连接后形成的 sgRNA)引导。此外，AacCas12b 不仅可以应用于靶标 dsDNA的剪切，其针对 ssDNA 的反式剪切活性还可用于靶标核酸的快速检测，详见本公司开发的 HOLMESv2[1]核酸快检技术。
产品组分
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组分 |
32116-01 (100 pmol) |
32116-03 (1,000 pmol) |
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AacCas12b Nuclease (10 μM) a |
100 pmol |
1,000 pmol |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
1 mL |
1 mL |
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Control Target DNA and sgRNAb |
5 μL |
5 μL |
a. AacCas12b Nuclease 浓度为 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 规格的总体积为 10 μL，1,000 pmol 规格的总体积为 100 μL；
b. Control Target DNA and sgRNA 应保存于-80℃并避免反复冻融，必须在 6 个月内使用，使用时建议取 0.5 μL 至每 20 μL 反应体系
保存条件
Control Target DNA and sgRNA 于-80℃储存，其余组分-20℃储存；≤ 0℃运输。
活性定义
在总体积为 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反应体系中，48℃反应条件下，1 min 内剪切 1 pmolssDNA 探针所需的 Cas12b 酶量定义为 1 transU。
例：若某批次 AacCas12b 酶的反式剪切活性为 3.0 transU/pmol，则表明 1 pmol 的该批次 AacCas12b
酶可在 1 min 内，在上述指定的反应条件下，反式剪切 3 pmol ssDNA 探针。本公司提供的 Cas 酶 transU
数值详见各批号的 COA 检测报告。
实验流程
1. 顺式剪切实验
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组分 |
体积 |
终浓度 |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
2 μL |
1 × |
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10 μM AacCas12b Nuclease |
0.5 μL |
250 nM |
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10 μM sgRNA |
0.5 μL |
250 nM |
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1 μM Target DNAc |
0.5 μL |
25 nM |
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Nuclease-free water |
Up to 20 μL |
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c. 顺式剪切体系中 Target DNA 可为 ssDNA 或带 PAM 序列的 dsDNA。 l
*若用核酸电泳来分析顺式剪切产物，建议使用 dsDNA靶标，因为 ssDNA靶标会被反式激活的 Cas12b 进一步切碎。对于 20 μL 顺式 剪切应体系，推荐 target DNA的使用量为 100 ng～500 ng，且 target DNA片段长度在 300 bp～3 kb 范围内。不同长度 target DNA需要 的 Cas 酶和 sgRNA的量需要根据 target DNA的摩尔量计算，建议保持 Cas 酶:sgRNA:target DNA的摩尔比为 10:10:1，以尽量确保 target DNA被剪切完全。
48℃反应 30 min~1 h，85℃灭活 5 min，核酸电泳分析顺式剪切产物。
2. 反式剪切实验
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组分 |
体积 |
终浓度 |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
2 μL |
1 × |
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10 μM AacCas12b Nuclease |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 μM sgRNA |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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1 μM Target DNAd |
0.5~5 μL |
25~250 nM |
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10 μM ssDNA Reporter |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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Nuclease-free water |
Up to 20 μL |
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d. 反式剪切体系中 Target DNA 可为 ssDNA 或带 PAM 序列的 dsDNA。 l
*反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，AacCas12b Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er1 稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的 Cas12 酶长期保存，请使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），sgRNA、 Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀释，但极低浓度的 Target DNA（例如 LOD 实验）建议用 0.1% Tween 20 稀释 并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。 l
*反式剪切体系中探针的用量和预期反应到达平台期的时间可参考各批号Cas 酶transU的具体数值，详见本公司提供的 COA检测报告。
实时荧光定量 PCR 仪检测荧光信号，48℃反应，每 30 sec 采集一次荧光信号。
实验结果
注意事项
1. Cas12b 的顺式剪切(cis-cleavage)：Cas12b 在 sgRNA 的引导下，特异性地剪切 target DNA。dsDNA 靶标需带有 PAM 位点，而 ssDNA 靶标不依赖 PAM 位点。
2. Cas12b 的反式剪切(trans-cleavage)：当 target DNA 存在时，Cas12b/sgRNA 与 target DNA 形成三元复合物(Cas12b/sgRNA/target DNA)，同时，Cas12b 被激发反式剪切活性，将反应系中任意序列的单链 DNA切碎。
3. 利用本产品的反式剪切活性进行分子诊断实验，可参考本公司的 HOLMESv2[1]体系。
4. 为防止 RNase 污染，请保持实验区干净整洁，操作时需穿戴干净的手套、口罩，实验用枪头、离心管等耗材均为 RNase-free。
5. AacCas12b 酶对热敏感，容易失活，应全程冰上配置反应体系，并在使用后立即将酶置于-20℃保存。
6. 本产品仅供科研使用。
参考文献
[1] Li L, Li S, Wu N, et al. HOLMESv2: A CRISPR-Cas12b-Assisted Platform for Nucleic Acid Detection andDNA Methylation Quantitation[J]. ACS Synthetic Biology. 2019, 8(10): 2228-2237.
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