DNA恒温快速扩增试剂盒（基础型）使用说明书

（货号：WLB8201KIT）

原理概述：

本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸。

产品特点：

本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需30 mins）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。

金属浴、水浴锅等即可进行反应操作，无需购买PCR扩增仪等价格高昂的专属设备。

引物设计：

建议使用长度在 30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；引物设计避免形成二级结构而影响扩增；扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。

试剂盒组成：

试剂盒储存：

运输条件：低温运输；

储存条件：储存温度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重压、反复冻融；

产品有效期：12个月。

操作步骤：提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。

1) 每个干粉反应管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响）；

2) 每个反应管分别加入2 μL上游引物和2 μL下游引物（引物浓度10 μM，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中）；

3) 向反应管中依次加入12.1 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为14.1 μL）;

4) 后向反应管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧，上下颠倒反应管8-10次混匀）；

5) 混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中37-39 oC孵育30 mins；

6) 反应结束后，加入50 μLfen/lv仿，1:1抽提反应液，12000 rpm离心5 mins，取5 μL上清进行电泳检测。（或者使用DNA产物纯化试剂盒处理反应液后进行电泳检测）

体系配制

*正对照反应单元体系配制：正对照模板加入2μL，引物加入4 μL正对照引物Mix（包含上/下游引物），其他组分参照体系配制。

注意事项：

1． 由于试剂盒灵敏度非常高，在进行反应时请注意避免微量待扩增核酸污染，并尽量考虑设置空白对照以确认是否有核酸污染。

2． 试剂盒保质期12个月。每次使用时，请取出实验所需的MIRA反应单元的数量，置于冰浴条件下并在8小时内使用；剩余部分，请置于存储条件下。