答：（1）试剂中各个功能蛋白不同。RPA试剂中的功能蛋白筛选了来源不同的各种酶，并且对某些酶进行了定点改造与修饰，使其核心功能酶体系效率更高同时体系更加完整。

（2）抗干扰能力和稳定性。RPA试剂对整个体系与辅因子（蛋白保护剂）的种类与浓度进行了一系列的筛选和生产冻干工艺上多方面优化，使其抗干扰能力与稳定性更强。

（3）多样化和个性化。得益于所有的功能蛋白自主生产和对该技术理论的深入了解，可以使RPA技术在应用上实现多样化，例如可以提供不同体系的试剂等，还可以根据客户的需求实现个性化的定制服务。例如，RT-nfo就是我们独有的，RPA在RT系列上的开发是失败的，最后退市了。

（4）具有最全的产品线，经过多年的探索优化，让RPA试剂在市场上同类产品竞争中占据优势。

RPA试剂的最适反应温度是多少？

答：RPA试剂的适宜反应温度区间为37℃～44℃（此温度范围内微小的温度差异不会对实验造成决定性的影响），根据试剂中酶的种类不同，荧光、基础等DNA产品的反应温度建议设为37℃~39℃，荧光、基础等RNA产品试剂盒的反应温度建议设为42℃～44℃，具体请参照说明书进行设置；如果要改变反应温度条件，请先进行实验验证。

可以改变R buffer（或A buffer）的用量吗？

答：不建议随意改变。buffer中的成分有最适宜的浓度，增加或减少加入量会改变反应体系中这些成分的浓度，从而对反应造成影响；如果考虑对下游结合其他实验的影响而必须改变用量的，最大调整量为不超过原有浓度的5%。再大则需自行进行实验调整确定与优化。

可以配制反应体系混合液进行试剂复溶吗？B buffer一定要最后加入反应吗？

答：可以，如果一组实验进行多个反应，可以配制反应体系的混合液，再分装复溶试剂。当模板不同时，可以将复溶buffer、引物、探针混合混匀后加到冻干试剂中进行复溶，然后分别加入不同模板，最后加入B buffer启动反应。

B buffer中的主要有效成分为镁离子，镁离子进入体系会立刻激活反应。尤其当做引物探针筛选有多个反应同时进行时，建议将B buffer加在试剂盖子上，以便混匀时同时启动反应。（最后加入B buffer主要目的是同步启动反应，从而可以更好的对比不同实验组扩增效果从而筛选引物探针）

A buffer和B buffer可以混合吗？

答：可以。但是当A buffer和B buffer混合后，A、B buffer混合液依然要在开始反应前最后加入反应体系。（后期的成品试剂已经在考虑将A和B buffer混合到一起）

RPA冻干试剂可以做成小体系吗？可以使用的最小反应体系是多少？

答：可以。冻干试剂可以根据客户需求进行体系的更改，但是对于体系内各组分浓度及比例与常规体系有差异。目前我们尝试的最小的RPA体系为10μL体系，但是不建议您自行将试剂体系进行分装使用，如果需要小体系试剂可以订购或定制相应的小体系试剂盒。

液体型试剂可以适当按比例减少或增加反应体系，不过最小反应体系建议不要小于20μl。

使用RPA液体试剂进行多次实验时，可以把不同组分混合后再储存吗?

答：不建议。RPA液体试剂中不同蛋白的缓冲保护剂不同，混合后长期放置会加速蛋白降解从而影响扩增结果。建议现用现配，剩余组分请及时在储存条件下保存。

RPA技术可以做多重反应吗？

答：可以，RPA技术可以在同一个试剂中进行多重扩增反应。不过，并非所有的引物组合都能在多重反应中很好地相互配合，因此对引物设计的要求更高。另外，注意反应中引物探针的总量(nmols)不应太多。进行多重荧光反应需要不同修饰的探针，必须考虑到检测设备的检测通道和合成公司可合成荧光基团的限制。（蛋白对引物会有偏爱性，导致多重检测很难做到全体灵敏度均一，因此需要调整引物探针用量和比例）

扩增完的反应产物可以保存吗？

答：如果您使用的是基础扩增试剂和胶体金试纸条试剂，反应产物可以在4℃短期保存，或在-20℃长期保存；建议将扩增产物进行抽提纯化后（促使蛋白和核酸分离），再进行保存。如果您使用的是荧光型试剂盒，反应产物则无法保存。

在进行RPA扩增反应时需要使用多少dNTPs？

答： 在所有冻干型试剂盒中，已经在冻干试剂加入足量的dNTPs，所以一般无需额外再加入。液体型试剂盒需自行添加dNTPs，建议体系中dNTPs 的终浓度至少为1.8mM（毫摩尔），可以参照说明书的用量添加；如需调整请实验验证。

RPA试剂可以用染料法进行实时检测吗？

答：理论上可以用染料进行终点检测，但是不能进行实时检测。RPA技术的荧光实时检测使用的是探针法。

是否可以使用PCR先筛选引物探针再用RPA试剂进行实验？

答：不建议，PCR和RPA两种技术的原理不同，引物的设计原则不同。PCR筛选好的引物应用到RPA体系中不一定好。这点从设计恒温引物不考虑Tm值就可以看出差异，RPA技术不需要高温变性，退火，因此设计引物不需要考虑Tm值；PCR的引物长度小于25bp，所以恒温扩增的引物要用恒温试剂去筛选。

另外，RPA探针和QPCR探针有差异，无法通过QPCR筛选RPA探针。

可以使用已有的qPCR探针吗？

答：不可以，QPCR和RPA两种技术的原理不同，探针的设计原则不同，探针长度，修饰结构和荧光信号释放机制都有差异。

荧光型探针中的[FAM-dT]修饰和[BHQ-dT]修饰间隔几个碱基最好？

答：理论上间隔1～3个碱基的淬灭效果最好，不过1～4个碱基的间隔都可以接受，不建议超过4个碱基，实际效果需要实验验证。

在突变较多的序列上如何设计探针？

答：可以将突变位点设计为简并碱基，一般探针上的简并碱基最好不超过5个，突变位置尽量不在5’端和3’端，带修饰的T碱基需要保守，最好不要选择有连续突变碱基的序列片段设计探针。

如何提高某一条特定引物的扩增效率？

答：当您已经筛选得到效率较高的引物但想在此基础上继续优化时，引物序列的微小改变也可能提高扩增效率：比如稍微改变引物长度（以1bp为单位延长或缩短），或稍微改变引物位置（以1bp为单位向前或者向后移动）。

对探针和引物有特殊的纯度要求吗？

答：一般带修饰的引物和探针选择HPLC纯化，普通引物选择PAGE纯化即可。

带生物素修饰或荧光标记的寡核苷酸引物可否进行基础扩增和琼脂糖凝胶电泳？

答：修饰在5’端的引物可以进行基础扩增，5’端带有生物素修饰或荧光基团标记的引物在RPA反应中与未修饰的引物工作相同。

上下游引物之间应相隔多远？

答：一般建议扩增片段的大小在80bp-500bp之间，200bp左右较为适宜。扩增片段实际大小应结合扩增检测需求来进行设计。

   如果是进行荧光法或者胶体金试纸条法，需要设计探针，建议留出可设计探针的足够长度间隔。

一般探针需要设计多长？

答：建议探针长度在46-52bp之间，具体可以参照我们相应的设计原则文件。

完成一个项目通常需要筛选多少对引物？

答：这取决于项目需要的灵敏度要求。如果灵敏度要求低，需要设计筛选的就少。如果灵敏度要求高，或者项目有特殊的要求，则需要进行系统的筛选更多的引物与探针。通常情况下，最初测试的引物一般在10-20对之间。筛选更多的引物探针越多，找到更优引物探针的机会越大。

好的引物是什么样子的？

答：引物的好坏并没有精确的理论准则，因此需要通过多组对比筛选出较优组合。灵敏度高、特异性强。

如何选择探针？

答：首先验证探针阴性结果是否正常，探针本身存在假阳性时需要淘汰；其次，在相同模板时选择TT值更小、相对荧光值更高、扩增曲线形态更好的探针。

为什么引物探针的非特异结构可能造成假阳性？

答：我们的探针上有个AP位点（THF），这个是酶切割探针的识别位点，探针与模板中的互补序列结合的时候，酶切割探针释放信号。如果探针本身或者和引物之间有非特异结构造成酶错误识别，从而有切割探针的情况，那就会有信号，也就是假阳性。

引物探针设计的时候需要分析是否有可能有非特异结构，非特异结构情况是否严重。但是理论预测和实际是不一定一致的，理论预测只是尽量去规避这种情况。引物探针的实际效果最终还得看实验。

筛选引物一定需要探针吗？

答：不一定。如果只是筛选基础扩增的引物，只需要用电泳法筛选引物即可；如果最终使用的是实时荧光法检测，则建议引物和探针同时进行筛选。胶体金不带探针筛也无所谓

可以通过琼脂糖凝胶电泳分析产物吗？

答：可以，不过如果是荧光型试剂则不建议进行电泳检测。荧光型试剂（EXO/RT-EXO）反应体系中的存在核酸外切酶，时间过长的话可能对实验结果有影响，要进行琼脂糖凝胶电泳检测，请使用基础扩增试剂（Basic/RT-basic）。

在进行琼脂糖凝胶电泳之前需要对扩增产物抽提纯化吗？可以用高温变形蛋白替代抽提吗？可以用产物纯化试剂盒进行纯化后电泳吗？

答：需要，RPA扩增反应中的蛋白质会干扰正常的琼脂糖凝胶电泳过程，如果没有用酚氯仿异戊醇（25:24:1）抽提去除蛋白，电泳结果可能得不到清晰干净的特异性条带。

不建议用高温变性法去蛋白，我们经过实验测试，高温变性并不能起到有效去除蛋白的效果，还是会对电泳分析产物造成影响。

可以用产物纯化试剂盒对反应产物进行纯化后再电泳，不过注意，我们对市场上部分纯化试剂盒进行过测试，很多品牌纯化试剂盒不能达到效果，会造成假阴性，另外纯化试剂盒操作相对抽提纯化也更为繁琐，所以还是建议直接抽提。

为何阴性也有拖带呢？

答：如果阴性出现与目的条带一致的条带，请考虑实验污染因素造成影响，并排除污染进行实验；如果是指阴性实验组存在一些非目的条带，大概在50-100bp左右，那应该是引物二聚体或多聚体造成的影响：引物扩增效率高，模板浓度高的情况下，引物形成二聚体的可能性低；引物扩增效率低或者模板浓度低的情况下引物二聚体或多聚体现象会严重，所以会出现一些引物二聚体条带现象。

可以使用基础试剂盒的扩增产物进行T-A克隆吗？

答：可以的。由于基础试剂中聚合酶不是Taq酶，不能在扩增产物的3’末端加上A，得到的DNA序列为平末端，因此需要在回收纯化后进行加A的过程，以BASIC回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP），72℃ 10分钟，然后将加A产物直接用于T-A连接。

RPA扩增反应可以使用荧光终点法检测吗？

答：可以，使用荧光终点法检测时，比较反应开始和结束时的荧光值，荧光值的增加表示扩增反应成功。但荧光终点发检测，只有两三次的荧光采集，结果不准确，无法根据扩增曲线和TT值判断结果。

如何提高荧光扩增曲线的重复性?

答：当做多个反应时，建议配制 A buffer、引物探针混合液，充分混匀后分装到各个反应管，减少误差；B buffer加在盖子上，加样完成后上下颠倒8-10次，充分混匀并同时启动反应，从而提高扩增曲线的重复性；对于低浓度模板，扩增曲线的不一致可能是由于到达了试剂分析极限，或者模板取样偏差，以及模板在反应体系中混匀不充分导致。

荧光检测方法中，反应时间和循环之间的关系，转化原则是什么？

答：RPA反应设定一般为每30秒采集一次荧光为一次循环，即30s/cycles，20分钟的反应共有40个循环。RPA的TT（CT）值与QPCR的CT值没有直接的对应关系或转化关系。

另外30秒采集一次荧光是一般设定，如果要设置更短或更长的采集时间也可以。

荧光基线高低不同是否会影响最终结果？

答：正常情况下，基线一般不会影响低浓度样本判断，荧光实验最终看的是相对荧光结果，仪器会进行基线归一的计算和处理，实验存在扩增的话荧光信号是会迅速放大的，没有这个现象就没发生扩增。

胶体金试纸条实验需要对扩增产物进行稀释吗？

答：需要。首先RPA反应液比较粘稠，如果不稀释的话，反应体系和产物无法有效被样品垫虹吸渗透，试纸条无法显色；其次稀释可以一定程度终止反应的作用；第三，RPA反应中的蛋白质会干扰横向流动带上的抗体，所以如果不充分稀释，容易产生非特异性结合和假阳性信号。（反应液取样量的20-30倍稀释）

可以使用带修饰的引物和基础试剂盒进行试纸条实验吗？

答：理论上可行。在上、下游引物分别修饰不同的基团，并用相应基团标记的试纸条进行检测实验即可。

不过更推荐您使用胶体金探针和NFO/RT-NFO试剂盒进行试纸条实验。因为当RPA试剂受到引物二聚体的影响，可能出现假阳性的问题，使用胶体金探针可以较好的避免这个问题。因为NFO酶只有在探针上的THF位点与其互补链结合时才能识别和切割。切割意味着探针的阻塞端脱落，可以起到引物的作用进行扩增。只有当产生你想要的扩增子时探针才能结合、被切割并延伸成为可以被胶体金试纸条捕获的扩增产物。

当使用小体系的RPA扩增反应时，如何确保它的重复性？

答：在进行小体系液体配制时，为尽可能减少人为误差，可以配制体系混合液，再依次不同组分；

   其次，小体系的反应体系不容易混匀，所以混匀操作更需要注意，以达到充分混匀反应体系的要求。

如何稀释冻干的引物探针？

答：请按照探针制造商的说明稀释和存储探针。通常，需先将含有冻干探针的小管高速（不低于10000rpm）离心5分钟，以收集引物探针冻干粉，然后根据需要的浓度加入相应体积的TE缓冲液或无菌水，稀释并充分混匀。稀释后的探针通常需要在-20°C避光保存。

每个反应体系使用的引物量？

答：建议50μL体系中每个扩增反应加入40nM~50 nM的引物。一般上游引物和下游引物各20nM，即在50μL体系中，10μM的引物，上下游引物各加入2μL。也可以通过实验进行引物量优化。

每个反应体系应该使用多少探针量？

答：一般建议每个扩增反应使用6nM探针。即50μL体系中，浓度为10μM的探针，加0.6 μL，也可以通过实验进行探针量优化。

用一种RPA试剂盒测试过的引物或探针，可以在同类型的RPA试剂盒中使用吗？

答：可以，不过不一定是最优的引物组合。如果您使用了基础型试剂盒进行了引物的测试筛选，那么在使用荧光型和胶体金型试剂盒时至少还需要设计一条对应的探针，这种变量可能导致基础型试剂盒的最优引物与荧光型、胶体金型的并不相同。

Buffer可以4℃保存吗？

答：如果短期内会进行较频繁的实验，试剂盒中的A（R） buffer和B buffer可以在4℃保存；但是试剂盒中的冻干试剂、正对照引物（探针）MIX、正对照模板等需-20℃保存。

试剂盒是常温运输吗？

答：试剂盒是使用冰袋和泡沫箱低温运输，以免受区域温度差异、季节温度差异、运输时长等因素的影响。建议收到试剂盒后立即放入储存温度（-20℃）下长期保存。

RPA试剂可以对模板进行定量检测吗？

答：RPA试剂主要应用于定性检测，理论上也可以进行相对定量检测。

RPA的循环数TT值和PCR的循环数Ct值可以相互转化吗？

答：RPA技术是恒温扩增，反应原理和循环概念与PCR不一样，无法直接转化。但是RPA中的TT值一般也可以反应初始样本浓度，初始样本浓度越高，则TT值越小，样本浓度越低则TT值越大。

荧光型试剂阴性异常的原因是什么？

答：首先考虑实验是否存在污染影响。实验中操作不规范，样本浓度过高，实验未分区，反应产物泄露或清理不及时等都可能造成实验污染，建议规范操作，分区实验降低污染风险。如果确认出现污染情况，建议使用紫外灯照射灭菌，并配合使用核酸清除剂和消毒液对操作区域进行彻底清洁和通风直至污染完全清除。

第二，可能是引物探针本身存在非特异性扩增导致，建议您在进行阳性实验之前先验证探针阴性结果是否正常，若探针本身异常，则需要重新设计筛选；

胶体金试纸条型试剂阴性异常的原因是什么？

答：首先考虑实验是否存在污染影响。实验中操作不规范，样本浓度过高，实验未分区等都可能造成实验污染。建议规范操作，分区实验降低污染风险。另外，胶体金试纸条实验显色需要开盖，核酸试纸条十分灵敏，操作不规范容易受气溶胶污染影响，建议在通风处显色。如果确认出现污染，建议使用紫外灯照射灭菌，并配合使用核酸清除剂和消毒液对操作区域进行彻底清洁和通风直至污染完全清除。

第二，可能是引物探针本身存在问题导致，建议您在进行阳性实验之前先验证探针阴性结果是否正常，若探针本身异常，则需要重新设计筛选；建议您在进行阳性实验之前，先进行全阴性测试，排除因引物探针的原因形成假阳性。如果引物探针存在假阳问题，则需重新设计引物探针。

为什么在荧光实验后期偶尔会出现二次起峰的情况？

答：通常是由于荧光反应中的聚合酶和核酸外切酶存在相互竞争。当反应耗尽能量时，核酸外切酶开始占主导地位，切割荧光探针加快释放了更多荧光信号，从而出现二次起峰。

另外若某一条特定探针一直存在二次起峰曲线，则该现象可能与探针本身相关。二次起峰理论上不影响扩增结果的判读。

引物探针设计不良为主要原因。

如何判定检测灵敏度浓度？

答：多次重复实验均能稳定检出的阳性最低样本浓度，是目前方案中的最低检测灵敏度。

对GC含量有什么要求？

答：PCR一般要求GC含量在30%到70%之间，但是超过70%仍然可以使用RPA进行扩增，例如，伪狂犬病毒的GC含量高过70%，仍然可以但是RPA技术做到很好的检测效果。

扩增产物浓度可以达到多少？

答：一般发生有效扩增的反应体系，最终扩增产物浓度可以超过10⁹cp/μL。

聚合酶保真性？

答：引物探针设计正常，扩增产物的保真性可以保证在99%以上。

最大可以加入多少样本量？

50微升体系的常规科研试剂盒，体系中无菌水的部分可以全部以核酸样本代替；如果对于样本加入量有额外的要求，可以定制试剂盒组分进行调整，我们可以通过浓缩buffer减少buffer加入体积来为您留出更多样本量空间。

相关产品：RPA试剂盒及试纸条系列：

货号	产品	规格
B8201C1	DNA恒温快速扩增试剂盒（DNA基础型）	48T
B8202C3	DNA恒温快速扩增试剂盒（DNA荧光型）	48T
B8203C5	DNA恒温快速扩增试剂盒（DNA试纸条型）	48T
B8204C7	RNA恒温快速扩增试剂盒（RNA基础型）	48T
B8205C9	RNA恒温快速扩增试剂盒（RNA荧光型）	48T
B8206C0	RNA恒温快速扩增试剂盒（RNA试纸条型）	48T
JY0209	双靶标HybriDetect侧向层析试纸条（彩虹型）	50T
JY0201	单靶标HybriDetect侧向层析试纸条（彩虹型）	50T
JY0307	CRISPR单酶切及扩增产物检测试纸条	50T
JY0301	CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条	50T
JY0308	CRISPR双酶切检测试纸条（变色龙）	50T

Cas酶系列

货号	包装规格	中文名称
32108-01	100 pmoL	LbCas12a (Cpf1)
32108-03	1,000 pmoL	LbCas12a (Cpf1)
32117-01	100 pmoL	LwaCas13a (C2c2)
32117-03	1,000 pmoL	LwaCas13a (C2c2)
32118-01	100 pmoL	AapCas12b (C2c1)
32118-03	1,000 pmoL	AapCas12b (C2c1)
32119-01	100 pmoL	Un1Cas12f1 (Cas14a1)
32119-03	1,000 pmoL	Un1Cas12f1 (Cas14a1)
32104-01	100 pmoL	AsCas12a (Cpf1)
32104-03	1,000 pmoL	AsCas12a (Cpf1)
32116-01	100 pmoL	AacCas12b (C2c1)
32116-03	1,000 pmoL	AacCas12b (C2c1)
32106-01	100 pmoL	FnCas12a (Cpf1)
32106-03	1,000 pmoL	FnCas12a (Cpf1)
32110-01	100 pmoL	Lb5Cas12a (Cpf1)
32110-03	1,000 pmoL	Lb5Cas12a (Cpf1)
32101-01	100 pmoL	SpCas9
32101-03	1,000 pmoL	SpCas9
32102-01	100 pmoL	Sp-dCas9
32102-03	1,000 pmoL	Sp-dCas9
32120-01	100 pmoL	Sp-nCas9（H840A）
32120-03	1,000 pmoL	Sp-nCas9（H840A）