为了创建无侵入性活体成像,作者们首先在活体胚胎植入前尝试可透性的荧光染料,其中SPY650-DNA可以用于标记基因组DNA,而SPY55-actin用于标记肌动蛋白,两种荧光标记具有很高的信噪比。此外,细胞周期持续时间、发育时间以及囊胚进展在荧光染料染色与未染色的胚胎中结果相似。这些结果说明了SPY650-DNA以及SPY55-actin可透性染料用于活体成像的无害性。另外,两种染色染色的结果与显微注射组蛋白H2B mRNA H2B-GFP以及肌动蛋白Utr-RFP所得到的标记结果类似(图1)。因而通过使用高通透性染料作者们实现了避免遗传操作进行活体胚胎成像的目标。
通过对人体胚胎活体成像,作者们发现人体囊胚发育细胞分裂过程中会出现错误,染色体滞留(Lagging chromosomes)并最终形成微核。与小鼠胚胎发育不同的是,人类胚胎的非整倍体不仅源于有丝分裂期染色体分离错误,也源于DNA的脱落,导致细胞质中出现DNA。另外,通过对DNA脱落时间进行分析,作者们发现这一现象只会出现在囊胚扩张的时间段而不会更早出现。
为了弄清楚囊胚发育中滋养外胚层细胞亚群中细胞分裂出现DNA脱落的原因,作者们对角蛋白丝的组织网络进行分析。角蛋白在各种组织中提供对细胞核的支持【1】。作者们发现将针对角蛋白K8以及K18的siRNA进行2细胞期显微注射,会导致其中一个细胞中角蛋白被破坏,并导致细胞核中DNA脱落增加,但是并不会影响caspase-3的阳性细胞数量。因此,该结果说明核周角蛋白表达较低滋养外胚层细胞更容易发生DNA脱落。核纤层蛋白LaminA在过表达K8以及K18 的胚胎中显著增加,同时胞质中DNA水平也降低。这些结果说明角蛋白提高对细胞核的保护作用,而机械应力会诱导DNA脱落。
总的来说,作者们的工作通过两种高通透性染料SPY650-DNA以及SPY55-actin实现了对人体胚胎的活体成像。用于临床监测或者遗传检测的胚胎活检造成对人体胚胎的机械应力胁迫,增加DNA脱落的几率,这一过程的机制与角蛋白对细胞核的支持作用相关。
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