CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条在CRISPR/Cas12a结合重组酶聚合酶扩增对水稻干尖线虫的敏感性和特异性检测实验中的应用

Aphelenchoides besseyi(A. besseyi)，也被称为水稻白尖线虫，具有一个广泛的宿主范围，超过200种植物都会被其寄宿，包括水稻。A. besseyi广泛分布于世界上几乎所有的水稻种植区，A. besseyi的严重侵扰可能导致高达50%的产量损失。A. besseyi是一种种子传播的线虫、

被感染的种子被认为是水稻白尖病的初始接种体的主要来源。一旦RWTD爆发，很难实施一个好的手段来彻底控制它因此，迫切需要开发可靠和快速的工具方法来检测和识别A. besseyi。

本研究中使用的实验材料有线虫。两份被A. besseyi感染的两个稻谷样品，AB1和AB2，分别采集自上海和南京的稻田相关的Aphelenchoides属，A. fragariae (AF)和A. subtenuis

(AS)，在上海口岸截获并保存在上海出入境检验检疫局。M. incognita (MI)由王选教授（南京农业大学，中国）慷慨提供。RPA引物、crRNA和ssDNA报由Sangon Biotech（中国上海）合成。RPA检测试剂盒(TwistAmp Basic kit, TABAS03KIT)购自TwistDx Ltd. (TwistDx Ltd., United Kingdom)。LbCas12a(cpf1)核酸酶（32108-03）购自Tolo Biotech(Tolo Biotech, Anhui, China)。横向流条（JY0301）购自Warbio Biotech公司。

建立RPA-Cas12a-Ab横向流条试验

为了进行现场检测，我们将RPA-Cas12a与LFA技术，建立了RPA-Cas12a-Ab LFA检测法（图1）。五个线虫样品（AB1、AB2、AF、AS和MI，表1）用RPA-Cas12a-Ab LFA检测。用RPA-Cas12a-Ab LFA测定法测试，其中A. besseyi样品（AB1和AB2）显示出与阳性对照一样的清晰测试带，并且没有交叉反应。阳性对照，而非A.besseyi样品（AF、AS和MI）没有发现交叉反应。这些结果证实了RPA-Cas12a-Ab LFA检测的特异性（图6A）。对参考质粒pUC57-18S进行10倍的连续稀释，以评估RPA-Cas12a-Ab LFA的敏感性。用来评估RPA-Cas12a-Ab LFA的敏感性。

检测的灵敏度。RPA-Cas12a-Ab LFA检测的LOD为103拷贝/μl（图6B），这与PCR检测（图5A）。然后我们测试了RPA-Cas12a-Ab LFA系统对A. besseyi样本的检测。最初的β-DNA提取的个体A.besseyi约为9.6纳克/微升，然后将DNA连续稀释。然后将DNA从1/100到1/106进行连续稀释。结果显示，1/100和1/101的稀释液产生了一个清晰的（图6C），这意味着RPA-Cas12a的检测极限为0。RPA-Cas12a-Ab LFA检测的检测限为0.96 ng/μl A. besseyi的gDNAi。

图5|评估RPA-Cas12抗体测定。(A)敏感性评估使用系列10倍稀释（1010?1副本/μl）pUC57-18质粒. (B)敏感性评价qPCR使用系列10倍稀释（105?0份/μl）pUC57-18S质粒. (C)敏感性评价RPACas12抗体荧光分析使用系列10倍稀释（1010?1副本/μl）57-18质粒. (D)敏感性评价RPA-Cas12a-抗体荧光分析使用系列10倍稀释（1-1/107） A. 线虫基因组DNA。一个单一的初始gDNA A. 贝塞约9.6 ng/μl。数据以平均±标准差（n = 3）表示。彼此之间有显著不同的拷贝数和序列稀释值在每个条形图上方用不同的小写字母标记。NTC，没有模板控制。

图6 - 建立RPA-Cas12a-Ab LFA检测法。(A) 评估RPA-Cas12a-Ab LFA检测的特异性。(B) 评估RPA-Cas12a-Ab LFA检测的敏感性。使用pUC57-18S质粒的连续10倍稀释液（1010-0拷贝/微升）评估RPA-Cas12a-Ab LFA检测的敏感性。(C) RPA-Cas12a-Ab LFA检测的敏感性评估，使用连续10倍稀释（1010-0拷贝/μl）的pUC57-18S质粒。连续10倍稀释（1/100-6)的单一A. besseyi线虫gDNA的敏感性评估。单个A. besseyi的初始gDNA约为9.6纳克/微升。质粒pUC57-18S被用作阳性对照。阳性对照；AB1, Aphelenchoides besseyi-1；AB2, Aphelenchoides besseyi-2；AS, Aphelenchoides subtenuis；AF, Aphelenchoides fragariae。MI, Meloidogyne

incognita；NTC，无模板对照。

讨论：

RWTD是水稻的一种典型的种源性疾病，它是由植物寄生的A besseyi导致。A. besseyi只有0.5-1毫米长，由1000-2000个细胞组成。据报道，大约92%的稻谷在圆锥体上有线虫。被A. besseyi感染的圆锥花序中，线虫的数量高达2014条/100粒。A. besseyi聚集在成熟的谷粒的颖轴内，并随着谷粒的干燥慢慢脱水。谷粒内，并随着谷粒的干燥而慢慢脱水。它们变成休眠状态，能够在种子储存期间存活 8 个月到 3 年。在种子播种后、休眠的A. besseyi迅速反应，开始新的生命循环。因此，准确与快速的检测A. besseyi是关键促进水稻种子的检疫和阻止RWTD的传播。由于同属的线虫在形态上有显著的局限性

由于同属的线虫的形态明显不同，分子方法，如PCR或qPCR，已被证明有助于检测A. besseyi。

然而，目前大多数基于PCR的检测方法在灵敏度和特异性等性能指标上有取舍，并且过度依赖具有先进设施的成熟实验室或训练有素的操作人员。在这项研究中，我们开发了一种新的检测方法，即RPA-Cas12aAb检测，通过将RPA与CRISPR/Cas12a相结合来检测A.besseyi（图1）。使用这种方法的好处是基于CRISPR/Cas12a的新检测方法。首先，与传统的检测相比，RPA-Cas12a-Ab不需要依赖复杂的设备。RPA扩增和CRISPR/Cas12a反应都可以在体温下完成，而且只需要一台荧光分析仪。只需要一台荧光分析仪就可以完成快速检测。对于现场检测，我们将RPA-Cas12aAb检测与LFA结合起来，无需任何设备就能在室温下读出结果。

第二，与传统的qPCR或基于PCR的检测方法的耗时性相比检测方法需要1-3小时，而新开发的RPA-Cas12a-Ab检测只需要45分钟，大大减少了显著减少了获得检测结果所需的时间结果。最后，RPA-Cas12a-Ab荧光检测法被证明比常规检测法具有更高的检测灵敏度。这种检测方法的LOD为1拷贝/μl、这比PCR和qPCR的灵敏度高得多。qPCR检测（图5A-C）。尽管采用了LFA技术来读取RPA-Cas12a-Ab的检测结果将增加LOD到103拷贝/μl（图6B），这种新的检测方法仍然足够强大，可以在45分钟内以高度的准确性和特异性检测出A.besseyi的存在。在45分钟内具有很高的准确性和特异性(图6A,C)。crRNA在引导Cas12a识别目标DNA方面起着重要作用，对于基于Cas12a的基因组编辑或分子检测的关键。通过严格选择crRNA的靶点避开基因组中的同源位点，可以最大限度地减少

基因组编辑中的 "脱靶"（Kadam等人，2018）。类似地、在crRNA靶点选择中避免保守序列是对于缓解基于Cas12a的分子检测的假阳性至关重要。检测的假阳性。在这项研究中，A. besseyi的ITS区域序列18S rRNA基因的ITS区序列被选为RPACas12a-Ab检测的目标序列。与rRNA基因区域相比，ITS区域进化得更快，并已被广泛地用作已被广泛地应用于线虫物种水平的诊断性标记. RPA-Cas12a-Ab检测的特异性得到了验证三种密切相关的非A. besseyi物种（图4，6A）。结果显示，该检测方法准确地检测了A. besseyiDNA，没有来自其他线虫的假阳性信号、证实了RPA-Cas12a-Ab检测对A.besseyi的特异性。

总之，我们开发了一种新的A. besseyi分子检测方法。检测方法，将CRISPR/Cas12a与RPA预扩增，并使用荧光分析仪或LFA。这种新的检测方法可以在45分钟内完成，不需要复杂的仪器和熟练的操作员。新的RPA-Cas12a-Ab检测方法的LOD可以达到1拷贝/μl（荧光检测），LFA测定可达到103拷贝/μl。因此，新的RPA-Cas12a-Ab是一种有希望的的分子方法，具有较高的准确性、敏感性和特异性、敏感度和特异性